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干干干干货!为什么你提取的RNA总是被降解?

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“大风起兮云飞扬,苍天佑我效率强”,以前上学的时候,每每提取RNA之前,都要默念几遍(我太难了。RNA提取怕是所有分子实验室的必备的技能了,但是提取的效果可能经常会有些不尽人意,忽好忽坏。

今天我们就来说说提取RNA被降解的那些事儿。

RNA样品特别容易受到环境因素影响,组织取出后没有马上处理或冷冻;待提取rna的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃;细胞在用胰酶处理时过度;溶液或离心管未经Rnase去除处理,这些都会导致辛苦提出的RNA被降解,特别是大名鼎鼎的RNA酶 (RNase),通常我们全副武装、小心翼翼,但还是会受到RNA酶的降解,核糖核酸酶(RNase)或称RNA酶,是一种可将RNA水解成小分子组成的核酸酶。RNase作为一个小分子的蛋白,却异常的稳定。常规的高温高压蒸汽灭菌和蛋白抑制剂都不能使它完全失活,听着就很顽固。

除了具有极佳的稳定性,RNA酶在实验室无处不在。它是生物的一种防御机制,对于一个细胞来说外源性的RNA往往是致命的,相比于外源性的DNA,外源性的RNA往往更加危险,一不注意外源性的RNA就愉快的转录翻译了,所以几乎所有的生物都进化出了RNA酶用来防御外源性RNA的入侵。因此实验室培养的细菌细胞以及提取RNA的你都散发着RNA酶的香气,人类的体液(唾液、眼泪等)甚至手指中都含有大量的RNA酶,所以操作时要戴好口罩,尽量避免与人交谈,还要做到勤换手套。

其次,操作时使用的仪器、耗材,包括枪头、离心管、移液器也要确保是无RNA酶的,刚刚说了单纯的灭菌是不能灭活RNase的,所以枪头和离心管要用DEPC处理,也就是说使用表明是DEPC处理的产品。移液器最好是有一套专用的,使用之前用75%的酒精擦拭干净,尤其是杆子。使用的水、缓冲剂要确保无RNA酶,使用的实验台面最起码要用75%的酒精擦拭,反正就是你实验过程中所用到的各种仪器设备,你都要对它了如指掌。

样本选择时一定要选取新鲜的样本组织或者取样后迅速低温处理(液氮速冻);样本出现多次反复冻融后,RNA得率会严重下降,也会导致RNA降解;对于血液样本,如果样本中含有血块,说明样本收集时未加入血液抗凝剂;建议重新收集样本并加入EDTA,肝素,柠檬酸等抗凝剂;

最后归纳一下:低温是关键,耗材处理好,全副武装少说话!

祝大家提的RNA浓度高,纯度好,实验顺顺利利。


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